Gudrun A. Rappold, Maki Fukami, Beate Niesler, Simone Schiller, Walter Zumkeller, Markus Bettendorf, Udo Heinrich, Elpis Vlachopapadoupoulou, Thomas Reinehr, Kazumichi Onigata and Tsutomu Ogata 

Institute of Human Genetics (G.A.R., M.F., B.N., S.S.) and Department of Pediatrics (M.B., U.H.), University of Heidelberg, 69120 Heidelberg, Germany; Children’s University Hospital (W.Z.), 06097 Halle, Germany; Department of Growth and Development, University of Athens (E.V.), 11527 Athens, Greece; Vestische Kinderklinik, University of Witten/Herdecke (T.R.), 45711 Datteln, Germany; Department of Pediatrics, Gunma University School of Medicine (K.O.), 371-8510 Maebashi City, Japan; and Department of Pediatrics, Keio University School of Medicine and Tokyo Electric Power Co. Hospital (T.O.), 160-0016 Tokyo, Japan 

摘要：矮身高的發(fā)生率在3%，是兒童常見疾病。特發(fā)性矮身高指的是不同未知病因的矮身高病人。最近證明人同源框基因-SHOX（矮身高同源框）與特納綜合征以及大部分Léri-Weill軟骨骨生成障礙病人的矮身高表型有關(guān)。本文特別研究了矮身高病人SHOX突變的發(fā)生率和類型。我們在750名病人使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性，分析SHOX基因內(nèi)突變；在150名病人使用熒光原位雜交方法，分析全基因缺失（總計(jì)900名病人）。這是目前研究SHOX突變的最大矮身高病人樣本組。所有病人有正常的核型，生活年齡的身高低于國家身高標(biāo)準(zhǔn)3rd百分位數(shù)或-2 SDS，診斷時均無明顯Leri-Weill綜合征骨骼特征。

在分析基因內(nèi)突變的750名病人中，鑒別出9名病人編碼SHOX區(qū)域有基因靜止、錯義、無義突變和小的缺失。在研究基因缺失的150名病人中，有3名病人完全的基因缺失。根據(jù)父母與正常對照的基因型與表型關(guān)系，9名基因內(nèi)突變的病人中，至少有3名是功能性的。我們結(jié)論，在2.4%的矮身高兒童中檢測出了SHOX突變。SHOX突變譜是偏斜的，大多數(shù)為完全缺失。在矮身高兒童中，由于SHOX基因突變矮身高的發(fā)生率似乎與GH缺乏或特納綜合征相似。SHOX突變兒童的家庭研究經(jīng)常揭示，有相同突變的年齡較大的家庭成員表現(xiàn)出類似特納綜合癥的輕微特征，例如高穹顎，短頸，關(guān)節(jié)發(fā)育異常，肘外翻，膝外翻，短第4掌骨和馬德隆畸形。

JCEM, 2002, 87(3):1402-1406.

許多矮身高兒童的病因尚不了解。因?yàn)橥ǔ４嬖诎砀叩募彝A向，所以推測遺傳因素可解釋這些兒童的矮身高。一個未解決的問題是：在當(dāng)前稱為特發(fā)性的病例中，未鑒別的單基因疾病在多大程度上引起生長障礙。

在過去的4年中，已經(jīng)證明位于X和Y染色體上擬常染色體區(qū)域內(nèi)的SHOX（矮身高基因框）基因與特納綜合征和Léri-Weill軟骨骨生成障礙（LWD）的矮身高有關(guān)。LWD是一種中肢性矮身高綜合征，以稱為馬德隆畸形的前臂骨異常為特征。在這兩種綜合征中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SHOX單倍體不足。最常見的特納綜合征為X染色體丟失(45,X)，在60%以上LWD病人存在SHOX基因缺失或點(diǎn)突變。特納綜合征和LWD的骨異常有共同之處，而特納綜合征的其它特征，例如卵巢障礙，淋巴水腫，心臟和腎臟異常則不相同。

雖然已經(jīng)證實(shí)特納綜合征和LWD的SHOX缺失，但目前對SHOX突變在單純矮身高病人的作用了解甚少。Rao et al.使用單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析(SSCP)，在91名病人中發(fā)現(xiàn)1例SHOX基因外顯子5無義突變，在家庭成員中與矮身高表型共分離。Binder et al.應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）方法，在68名病人中報(bào)告了1例的矮身高并SHOX基因缺失病人。

為了更全面評估矮身高病人SHOX突變發(fā)生率和類型，我們使用有不同突變檢測范圍的SSCP和FISH方法，分析了SHOX基因區(qū)域。對900名矮身高兒童的研究結(jié)果表明矮身高病人SHOX突變的發(fā)生率為2.4%。

受試者和方法

病人

使用下列標(biāo)準(zhǔn)募集了900名男女矮身高病人：生活年齡身高低于國家生長標(biāo)準(zhǔn)3rd百分位數(shù)或-2 SDS，無已知病因（包括骨發(fā)育異常和性腺生殖障礙），食物攝取正常，核型正常。矮身高兒童來自3個不同的國家（日本，德國和希臘）。在900名病人中，日本623名，德國249名，希臘28名。因?yàn)椴糠轴t(yī)生提供了DNA，而其它醫(yī)生提供了中期染色體涂片，所以750名病人使用SSCP篩查，150名病人使用FISH篩查。750名病人中有474男，276女；150名病人中有79女，71男。兩人群年齡范圍相似，所有矮身高兒童均無親屬關(guān)系，經(jīng)過內(nèi)分泌醫(yī)生診斷。在取血樣時，獲得所有病人的完全病史。該研究得到管理委員會批準(zhǔn)，由病人和合法監(jiān)護(hù)人取得知情同意書。使用100名正常身高、正常核型并無特定疾病個體的DNA作為對照。

SSCP突變分析

使用標(biāo)準(zhǔn)方法，由外周血液淋巴細(xì)胞提取DNA。使用以前報(bào)告的方法進(jìn)行PCR和SSCP分析。對每一個體病人的DNA完成8次不同的PCR擴(kuò)增，覆蓋全部SHOXa的蛋白編碼區(qū)域，以及5’-非翻譯區(qū)（外顯子2~6a）。

PCR產(chǎn)物克隆和測序

PCR產(chǎn)物被克隆入pCR2.1-TOPO載體。使用循環(huán)測序法分別進(jìn)行3次每等位基因克隆的測序，并以以前報(bào)告的方法在自動測序儀上分析。

FISH分析

在以前報(bào)告的條件下，以LLNOYCO3′M′34F5生物素標(biāo)記的粘性質(zhì)粒DNA與病人刺激的淋巴細(xì)胞中期染色體雜交。經(jīng)過抗生物素蛋白結(jié)合的異硫氰酸熒光素檢測雜交的探針。

結(jié)果

在750名矮身高病人篩查SHOXa編碼區(qū)域的基因內(nèi)突變，遍布5個外顯子（外顯子2~6a）。在外顯子2(A-337G, C37T, C64G)和外顯子6a(G761A)鑒別出了新突變，編碼A224T替代和delC776-G787，導(dǎo)致4個氨基酸H229–L232的缺失。在100名正常身高對照個體未見這些突變（除A-337G外）。通過以AluI (在A-337G), Hin6I (C37T), SmaI (C64G),和DdeI (C674T)消化各自PCR產(chǎn)物，證實(shí)了這些突變，盡管在G761A突變的AccII限制性酶切位點(diǎn)被破壞。所有女性病人的突變(A-337G, C37T, C674T, G761A)為不同的雜合性。在2名ISS個體發(fā)現(xiàn)了以前所鑒別出的C674T (R195X)（表1）。根據(jù)父母的基因型-表型關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SSCP分析的750名病人中至少有3名（0.4%）為功能性基因內(nèi)突變。我們根據(jù)病人與父母和正常身高受試者間的基因型-表型關(guān)系，確定了一種突變的功能性。6種突變中的4種位于基因的非編碼區(qū)域，并不翻譯蛋白。在正常身高個體也檢測出了外顯子6a的2種突變。因此，有充分的理由假設(shè)，6種突變的確為功能性多態(tài)性。

在研究過程中，看到LWD病人的SHOX突變范圍有相當(dāng)大的偏斜，大部分為基因完全缺失。為了確定以往在LWD病人報(bào)告的基因完全缺失是否也出現(xiàn)在矮身高病人，通過對中期染色體使用FISH，分析150名病人的DNA樣本。在20%的兒童（150名中有3名）檢測出完全的SHOX缺失。結(jié)果提示，ISS病人的基因缺失普遍為功能性SHOX突變，出現(xiàn)頻數(shù)為基因內(nèi)突變的5倍以上?？傊?，本研究結(jié)果表明，ISS病人的功能性突變?yōu)?.4%。

我們的以及其它實(shí)驗(yàn)室檢測的LWD病人突變數(shù)據(jù)表現(xiàn)出了其它更加普遍的特征（表2）。完全SHOX缺失兒童的表型與點(diǎn)突變病人無差別，與基因的其它區(qū)域相比，同源框區(qū)域內(nèi)的突變頻數(shù)未顯著增加。反而，突變似乎遍及全部基因。至今，尚未發(fā)現(xiàn)SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)和OAR結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)域的突變（圖1）。導(dǎo)致蛋白截?cái)嗟臒o義突變是基因內(nèi)突變的主要類型，而且發(fā)現(xiàn)存在于約2/3的病人（表2）。C674T突變是最多的點(diǎn)突變，導(dǎo)致密碼子R195X和蛋白鏈的終止，在4名ISS和LWD病人發(fā)現(xiàn)了這種突變（圖1和表2）。

討論

SHOX基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，主要控制發(fā)育過程。SHOX的同源基因存在于雞、魚和其它脊椎動物，提示該基因?qū)Πl(fā)育有重要作用。受孕后32天的人類胚胎，在發(fā)育中的四肢發(fā)現(xiàn)了SHOX基因表達(dá)的最早證據(jù)。

已經(jīng)證明SHOX基因逃逸了X的失活，在有活性和無活性的X和Y染色體表達(dá)等位基因。在過去的幾年中，逐漸了解到SHOX單倍體不足導(dǎo)致矮身高顯性表型和間或的其它骨骼異常，例如馬德隆畸形。常見表現(xiàn)存在家庭內(nèi)和家庭間的異質(zhì)性，女性更常見疾病表型并更嚴(yán)重。因?yàn)閱伪扼w不足綜合征的基本作用是擾亂精確平衡的時空表達(dá)，所以表達(dá)水平的變化解釋了SHOX突變顯示的嚴(yán)重程度。在LWD綜合征和ISS表型可能出現(xiàn)相同的SHOX突變，也提示了SHOX表型復(fù)雜的遺傳型和表型的異質(zhì)性。修飾基因，外成遺傳相互作用和隨機(jī)效應(yīng)可能解釋了這些現(xiàn)象。

雖然在60~100%的LWD征兆的病人發(fā)現(xiàn)了SHOX突變，但我們的研究證實(shí)，2.4%的無明顯骨畸形的矮身高病人也存在功能性SHOX突變。在2.4%之中，2.0%是基因完全缺失，0.4%是基因內(nèi)突變。與其它已經(jīng)確認(rèn)的生長障礙病因相比，SHOX的發(fā)生率如何呢？2.4%的ISS病人存在SHOX突變說明人群發(fā)生率至少為1/2000。相比之下，已經(jīng)確認(rèn)，在3500名兒童中有1例的典型GH缺乏，在2500名女孩中或5000名兒童中有1例的特納綜合征。因此，在ISS兒童中，因SHOX基因缺失而矮身高的發(fā)生率與GH缺乏或特納綜合征相似。

在我們的檢測分析中可能遺漏了一定比例的突變病例。對于SSCP，估計(jì)檢測突變的敏感性為80%。再者，并不都是轉(zhuǎn)錄定位存在缺陷。顯然，ISS和LWD病人SHOX突變范圍高度偏斜，大部分表現(xiàn)為基因完全缺失。雖然染色體DNA的大部缺失通常罕見，但是，擬常染色體區(qū)域中銜接或散在重復(fù)序列優(yōu)勢可容易地理解SHOX缺失的高發(fā)生率。

有趣的是，SHOX單倍體不足的骨異常發(fā)生率似乎隨年齡而增加。例如，其中1名病人(J451)在7歲時沒有骨異常表現(xiàn)，但在4年后的青春期中表現(xiàn)出邊緣性的肘外翻和馬德隆畸形。這種現(xiàn)象與性腺類固醇引起SHOX單倍體不足病人生長板過早融合不平衡而加重畸形的假設(shè)相一致。這種影響可能以女性優(yōu)勢和青春期速度影響的方式加重了骨骼的損害。

根據(jù)本研究數(shù)據(jù)和以往的研究報(bào)告可得出一個重要的結(jié)論，突變類型和基因內(nèi)位置與結(jié)果表型之間無相關(guān)。同樣，完全基因缺失或基因內(nèi)無效突變的表型表現(xiàn)無差異。因此，與SHOX相關(guān)的矮身高分子學(xué)基礎(chǔ)為，由于一個等位基因功能缺失，導(dǎo)致總活性減少50%（單倍體不足）所致。此外，純合子SHOX突變導(dǎo)致蘭格侏儒癥（肢中性）的顯著表型，而SHOX的過量表達(dá)，例如克蘭費(fèi)爾特綜合征（Klinefelter syndrome），引起或貢獻(xiàn)于長四肢和高身高。

在過去的10年中，臨床研究證明重組GH能夠有效、安全的增加特納綜合征兒童的最終身高。特納綜合征的矮身高和其它有或無骨發(fā)育異常的SHOX缺陷病人的主要病因是SHOX基因單倍體不足。因?yàn)镚H也能有效治療ISS和特納綜合征兒童，所以已經(jīng)提出，GH治療可能也改善有SHOX缺陷的非特納綜合征兒童的生長速度和最終身高的假設(shè)，一項(xiàng)正式的、有同期隨機(jī)未治療對照組的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中，以對這個假設(shè)進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)。