摘要：在某些特發(fā)性矮身高和許多萊里-韋爾（Leri-Weill）軟骨骨生成障礙病人，SHOX（short stature homeobox-containing gene）突變引起單倍體不足（haploinsufficiency）。約80%的SHOX 突變?yōu)榛蛲耆笔?，其余的為各種點突變。本文目的為估價特發(fā)性矮身高兒童SHOX突變的發(fā)生率，提出單倍體不足的表型特征。我們募集了140名特發(fā)性矮身高兒童（61女）。特發(fā)性矮身高的定義為，有正常IGF-I和自由睪酮、女性有正常的核型，無肌內膜抗體、長期器質性、心理性或綜合癥疾病，并且無明顯的骨發(fā)育異常征兆。測量記錄身高、臂展、坐高，計算坐骨下腿長。以熒光引物PCR擴增SHOX編碼區(qū)域附近兩個高度多態(tài)性微衛(wèi)星標記(CA-SHOX 重復和DXYS233)，并以自動測序儀分離。對每一標記僅有1個片段大小的淵源者分析父母的DNA。在三個淵源者（2%）證實了由SHOX缺失引起的SHOX單倍體不足，三名病人都為女性，攜帶有父親等位基因的全部缺失。與其它137名檢測的兒童相比，臂、腿顯著縮短而有低-正常的坐高。因此，3名SHOX單倍體不足淵源者的肢體/軀干比例（腿長與臂展之和除以坐高）顯著低于全組病人。這個觀察結果得到另外5名以前診斷為SHOX單倍體不足病人（4女）生長學數據的證實，除了一名年齡最小的女孩外，以身高調整的肢體/軀干比例低于平均數1SD以上。所有SHOX單倍體不足的兒童至少表現出一種萊里-韋爾軟骨骨生成障礙的X線表現特征——遠側橈骨骺三角形化、遠側排腕骨的錐體化、橈骨遠側尺骨端透明。我們的觀察提示，可以肢體/軀干比例低于1.95+1/2身高（m）和手腕X線片的重要判斷篩選SHOX突變的兒童。

(J Clin Endocrinol Metab 88: 4891–4896, 2003)

在某些特發(fā)性矮身高（idiopathic short stature，ISS）和許多Leri-Weill軟骨骨生成障礙（Leri-Weill-dyschondrosteosis，LWD)病人，已經報告了引起單倍體不足的擬常染色體SHOX（矮身高同源框基因）雜合性突變。Leri-Weill軟骨骨生成障礙是一種骨軟骨發(fā)育不良癥，有肢中性矮身高和腕部馬德隆畸形表現。由妊娠第二個月，SHOX開始在人類胚胎成骨細胞中表達。選擇性剪接生成兩種蛋白，其中非截短的SHOXa引起體外基因轉錄。在骨的個體發(fā)生、骨代謝和生長的調節(jié)中，它的確切作用尚不了解。約80%的SHOX突變?yōu)橥耆蛉笔?，其余為點突變。除了不成比例的矮身高外，LWD病人的常見征兆為肘外翻，高腭穹和脊柱側凸，與在染色體畸變基礎上有SHOX缺失的特納綜合征女性的部分表型相類似。甚至在同一家庭，SHOX單倍體不足的表型高度可變，說明了較差的基因型-表型關系。最初，在一名特發(fā)性矮身高兒童發(fā)現SHOX突變提出了兩個問題：1）迄今有多少未知病因（特發(fā)性）的矮身高兒童有SHOX單倍體不足？2）在臨床上能夠識別表型嗎？最近，Rappold et al.報告了特發(fā)性矮身高兒童SHOX缺陷的發(fā)生率，但研究中未排除父母有馬德隆畸形的個體，也無生長學和放射學確切數據。與此相反，其它兩個研究組未發(fā)現特發(fā)性矮身高兒童的SHOX缺陷，而是在矮身高和LWD的幾名淵源者發(fā)現有SHOX缺陷。

在本文中，我們報告了140名具有特發(fā)性矮身高特征的兒童所進行的SHOX缺失篩查結果。在此基礎上，我們提出特發(fā)性矮身高學齡兒童生長學判斷方法，在骨骼生長不成比例個體中確定SHOX分子學分析的候選者。而且也討論了特定X線表現的作用。

受試者和方法

個體

為了SHOX缺失篩查，由我們生長研究中心3名有經驗的兒科內分泌醫(yī)師募集了140名（61女）特發(fā)性矮身高兒童。年齡范圍在2.6~16.1歲（中位數9.1歲）。特發(fā)性矮身高定義為：IGF-I和自由T4正常，女性核型正常，無肌內膜抗體，無長期器質性、心理性或畸形疾病，無明顯骨發(fā)育不良征兆（包括馬德隆畸形）。這些標準依據于特發(fā)性矮身高定義共識。記錄身高、臂展和坐高，計算坐骨下腿長。經證實為SHOX的淵源者要在我們診所再次檢測，并再次拍攝左手腕X線片。也再次分析了10名肢體最短、無SHOX缺失的淵源者。此外，再次回顧性分析我們診所以前檢測出的SHOX單倍體不足兒童（n=5）的生長學和放射學數據。

所有SD分值依據荷蘭標準計算。有所有兒童和/父母得到知情同意書。

方法

由血液淋巴細胞提取基因組DNA。使用熒光引物PCR擴增位于Xp22.3前后和SHOX基因座的兩個高度多態(tài)性微衛(wèi)星，并以自動測序儀器分離。以SHOX末端定位CA-SHOX重復，DXYS233周圍300–350 kb位于SHOX近側。如果二者端粒標記(DXYS233, CA-SHOX 重復)之一僅有1個片段大小，則進行父母DNA分析。這種分析能夠使我們區(qū)分純合子（相同大小的兩等位基因）與半合子（缺失一個等位基因）。

統計學分析

在所有生長學參數正態(tài)分布的基礎上，當3名SHOX缺失兒童的數值在無SHOX缺失兒童組95%置信區(qū)間之外時，為有統計學顯著性差異。使用JMO 4.0.5版軟件進行統計分析。

結果

通過位于SHOX基因座和2個微衛(wèi)星標記的擴增，在11名淵源者（7%）發(fā)現2標記僅有單一片段，提示了半合子或純合子SHOX基因座。在11名淵源者中，僅8名有父母DNA，但有2名是不提供信息的。通過父母等位基因擴增，在3名女孩（2%）證實了SHOX缺失的半合子（圖1）。通過以前報告的3個常染色體標記的擴增證明為父系。不提供信息的以及缺少父母DNA的5名淵源者未排除SHOX缺失。

3名受累淵源者的生長學特征為短坐骨下腿長、短臂展但有低-正常的坐高（相對于年齡）。為進一步分析這一結果，我們將其與其它SHOX缺失陰性的137名淵源者的生長學數據進行了比較（表1和圖2A-C）。3名受累淵源者的靶身高和體重（年齡的SDS）在未受累組的95%的置信區(qū)間之內，但SHOX缺失女孩的骨骼比例與無SHOX缺失淵源者顯著不同。證實了骨不成比例是一個特殊的表現（表1）。當依身高繪制臂展、腿長和坐高圖時（圖2A-C），這種表現也同樣明顯。

為了將骨不成比例的相關數據整合為一項，我們確定了一項生長學比值，將肢體與軀干長度相比較（下面稱為及肢體/軀干比）。肢體/軀干比的定義為，（坐骨下腿長+臂展）/坐高。因此，有高肢體/軀干比為不成比例短肢體的矮身高兒童。圖3為所有淵源者依身高的肢體/軀干比。該圖示強調了在所有研究的特發(fā)性矮身高兒童中，3名SHOX缺失淵源者的骨不成比例（實心圓）的高度特殊性表現。肢體/軀干比例直線隨年齡和身高而增加，反應了兒童期，臂和腿生理性生長的速度高于軀干。

因此，我們的數據提示，在特發(fā)性矮身高兒童亞組篩查SHOX突變是最合理的，即篩查那些有低肢體/軀干比例表現的特發(fā)性矮身高兒童。如果篩查上限定義為肢體/軀干比例低于身高調整的平均數下1SDS，那么這樣的生長學標準可使約84%的矮身高兒童免于遺傳學篩查檢測。近似計算為小于1.95+1/2身高(m)，即圖3中的點線。為了檢驗這樣一種篩查方法的敏感性，我們搜集了所有突變篩查中被排除的SHOX單倍體不足兒童的數據（n=5,4女），被排除的病人為有明顯馬德隆畸形（4號病人），Rao et al.報告的已知SHOX無義突變（5和6號病人），以及含有SHOX基因座的Xp末端著絲粒缺失（7和8號病人），表2。所有SHOX單倍體不足學齡兒童的肢體/軀干比例都低于這一限度，說明在這一組SHOX單倍體不足學齡兒童，篩查方法有高度敏感性（100%），圖3。但是，骨不成比例的程度不同，該組中有一名年齡最小、身高最矮的兒童（5號病人）有較低而正常的肢體/軀干比例（身高2510px下2.51），但在一段時間后，下降到了低點（身高3132.5px下的2.45）。在她的受累的哥哥（6號病人），也觀察到隨時間的進展骨不成比例程度加大（身高2927.5px時為2.50，在身高3615px時為2.48）。

因此，根據我們的數據，在檢測SHOX單倍體不足學齡兒童時，上述定義的肢體/軀干低于1.95+1/2身高(m)有100%的敏感性和85%的特異性。如果矮身高兒童SHOX單倍體不足發(fā)生率為2%，那么肢體/軀干比例小于1.95+1/2身高(m)矮身高學齡兒童有SHOX單倍體不足的可能性為12%（檢測的陽性預測值）。更有趣的是，在身高110cm以上，肢體/軀干比例在1.95+1/2身高(m)之上的矮身高學齡兒童100%的沒有SHOX單倍體不足（陰性預測值）。但是（如5號病人），學齡前兒童以及矮于110cm的兒童，這個檢驗有較低的敏感性和特異性，要小心應用。

最后，本研究中的三名SHOX缺失淵源者以及其它以前檢出SHOX單倍體不足的5名病人常規(guī)左手腕X線片異常，表現出LWD的特征：遠側橈骨三角形化（88%），遠側排腕骨椎體化（88%）和橈骨的遠側尺骨側透X光。因為我們的遺傳學方法未能檢測所有可能的SHOX缺失和SHOX點突變，所以我們在無SHOX缺失淵源者組也分析了10名有最低肢體/軀干比例病人的手腕X線片。有趣的是，10名病人中有1名女性有輕微馬德隆畸形表現，可能是由于未檢測出的點突變，或是其它未知基因突變引起LWD。此外，10名病人中，2名兒童（3.8歲和5.5歲）屬于SHOX標記僅有單一片段大小的5名病人組，他們的父母DNA不可提供信息或是沒有樣本。

討論

SHOX是影響生長的重要基因，它的發(fā)現提出了一個問題，該基因多大程度的突變貢獻于以前所診斷的特發(fā)性的矮身高。與特發(fā)性寬大的定義不同，最近的一個專家會議詳細定義了特發(fā)性矮身高，并由定義中排除了異常身體比例的兒童。定義的理論根據將寬大范圍的骨軟骨發(fā)育不良排除在特發(fā)性矮身高術語之外。但是，不要忘記，對矮身高所進行的生長學評價并不全面，常常為臨床觀察所代替，可能忽視輕微的骨不成比例。

本文結果與以前的未知病因特發(fā)性矮身高兒童常見SHOX突變的研究相一致，估價的發(fā)生率至少1-2%?？紤]到有一定百分數的SHOX突變個體并非矮身高，SHOX突變的檢測尚不完全，總人群中SHOX突變發(fā)生率至少為1：4000似乎是可靠的估計。因此， 很可能SHOX突變比成纖維細胞生長因子受體（FGFR）3突變更為多見，估計軟骨發(fā)育不全的發(fā)生率在1：15000和1：40000之間，然而，FGFR3突變引起的軟骨發(fā)育不良和某些罕見的骨發(fā)育不全的發(fā)生率還不清楚。

因SHOX單倍不足有高發(fā)生率，所以確定及早診斷矮身高兒童的標準是重要的，特別是在證明了重組GH能有效促進生長的情況下。通過搜集所研究兒童所有的生長學數據，我們觀察到，與陰性篩查結果相比，所有SHOX單倍體不足學齡兒童有明確的不成比例的臂和腿的縮短。其它研究者也觀察到了相似的SHOX單倍體不足所引起的骨不成比例，但是，因為所有的淵源者為LWD家庭成員，他們搜集的數據有偏差。通過整合3個普遍使用的生長學指標，骨不成比例可定量為一項，我們稱其為肢體/軀干比例，可直接將肢體長度（坐骨下腿長+臂展）與軀干長度（坐高）相比較。我們的數據提示，在以身高調整的低肢體/軀干比例 [<1.95 + 1/2 height (m)] 矮身高學齡兒童中，SHOX突變的可能性約為12%。另一方面，正?；蚋叩闹w/軀干比例排除了SHOX突變。在身高低于110cm的學齡前兒童，這個規(guī)律是不可靠的，因為SHOX單倍體不足引起的骨不成比例尚未充分地顯現。

最近，Rappold et al.報告了矮身高兒童的突變篩查，檢測出6名功能性SHOX突變。在4名有骨骼變形資料的兒童中，3名骨不成比例。但是，未列出身體比例的生長學數據。在最早發(fā)現SHOX的報告中，兩兄弟攜帶無義突變，也并入本文中的受累對照組（5，6號病人）中。在6歲和8歲時他們最初被診斷為特發(fā)性矮身高。在一段時間內，二者都出現了骨不成比例，完全符合LWD的診斷。因此，低年齡兒童的臨床診斷是困難的，特別是在骨不成比例尚未出現的學齡前兒童。就像在LWD家庭中一樣，所謂的特發(fā)性矮身高組中，男性較少（本研究中3名女性，無男性，參考文獻2中5名女無男），但兩篩查組中男性較多（56%和60%）。因此，其它研究中的女性發(fā)生率不是篩查偏差的問題，而更可能是至今未知的基礎機制的結果。

除了生長學外，由常規(guī)左手X線片形態(tài)學分析可以得出二線證據。雖然僅一名對照受累病人存在馬德隆畸形，但我們在所有8名SHOX單倍體不足兒童檢查出了輕微LWD腕發(fā)育異常特征。橈骨遠側尺側緣的透明是LWD引起腕異常的早期特殊征兆，但是僅出現于半數受累兒童之中。相比之下，在除一名年幼兒童外，所有SHOX單倍體不足兒童都存在橈骨三角形化和腕骨錐形化。Ross et al.發(fā)現，在SHOX單倍體不足的LWD家庭的42名淵源者中，僅有74%的受試者有類似于馬德隆畸形的腕骨放射學異常。但是，在馬德隆畸形陰性的9名淵源者中，7名兒童的年齡在9歲以下。因此，他們的腕骨、橈骨骨化尚未達到能詳細進行放射學評價的程度。Schiller et al.報告了SHOX單倍體不足成年人的馬德隆畸形的臨床和放射學表現，強調了兒童期馬德隆畸形的最初征兆，例如腕部楔形是X線唯一可檢測的特征?？傊^大部分SHOX單倍體不足病人可能出現馬德隆畸形。兒童期放射學診斷的缺點是橈骨骺骨化尚不充分，在女孩骨齡9歲、男孩骨齡11歲才足以能夠診斷。因此，如果SHOX突變?yōu)榉峭耆笔У模瑧斶M行受累父母的放射學（臨床）分析。

結論，我們的遺傳學和臨床分析說明，SHOX單倍體不足引起典型的骨不成比例和腕部異常，對絕大部分學齡兒童進行詳細的生長學和放射學分析即可鑒別。應對肢體/軀干比例不足1.95 + 1/2 身高 (m)的矮身高學齡兒童進行SHOX突變篩選。如果骨成熟度達到并有放射學經驗情況下，篩查目標組可以進一步縮小到有馬德隆畸形放射學征兆的兒童。SHOX單倍體不足表型類似于所有程度的LWD，似乎比FGFR3突變引起的矮身高表型更為常見。

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